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離心分離方法與應(yīng)用

離心技術(shù)

離心是利用旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)的離心力以及物質(zhì)的沉降系數(shù)或浮力密度的差異進(jìn)行分離、濃縮和提純的一種方法。顆粒的沉降速度取決于離心機(jī)的轉(zhuǎn)速及其自身與中心軸的距離。不同大小、形狀和密度的顆粒會(huì)以不同的速度沉降。

懸浮在液體中的固相顆粒的運(yùn)動(dòng)速度取決于：

1．重力——液體中的顆粒處在重力場(chǎng)內(nèi)時(shí)，如在一支平穩(wěn)的試管內(nèi)，將會(huì)受到地球的重力的作用而運(yùn)動(dòng)。

2．固液相對(duì)密度的差別——相對(duì)密度小于液相的顆粒懸浮在上面，相對(duì)密度大于液相的顆粒則沉淀下來。

3．顆粒的大小與形狀。

4．沉降介質(zhì)的粘滯力。

一、離心力的計(jì)算：

離心機(jī)的加速度通常以重力加速度（g=9.80m/s²）的倍數(shù)來表示，稱為相對(duì)離心力（RCF或“g值”）。RCF取決于轉(zhuǎn)子的轉(zhuǎn)速（n，以每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)計(jì)r/min）和旋轉(zhuǎn)半徑（r，以mm計(jì)），可用公式表示如下：

此公式變形后，在已知r和RCF的值時(shí)可以用來計(jì)算轉(zhuǎn)速（r/min）：

然而，須注意到RCF值在離心管內(nèi)并不是處處相等：在靠近轉(zhuǎn)子外側(cè)處的值z(mì)ui大（r_max）靠近中心軸處的值z(mì)ui?。?/span>r_min）。應(yīng)用中，習(xí)慣上所說的RCF值都是指旋轉(zhuǎn)的平均半徑（r_av）。另外，需注意的是RCF的值是轉(zhuǎn)速值的平方的函數(shù)，因此增加41%的速度就可使RCF提高兩倍。

二、離心分離的方法：

1．差速沉降（沉淀）法：

將一混合懸浮液以一定的RCF離心一定的時(shí)間后，混合物將會(huì)被分為沉淀和上清液兩部分。從一種懸浮液中，增加RCF，以固定的離心時(shí)間連續(xù)分離沉淀的方法被廣泛應(yīng)用于從細(xì)胞勻漿中分離細(xì)胞器。(a)離心前盛在離心管內(nèi)的是含有大、中、小三種顆粒的懸浮液；（b）低速離心后，沉淀主要由zui大的顆粒組成；（c）進(jìn)一步用高速離心上清液，得到主要由中等大小顆粒組成的第二種沉淀；（d）zui后一步用離心把余下的小顆粒沉淀下來。

差速離心法主要用于分離細(xì)胞器和病毒。其優(yōu)點(diǎn)是：操作簡(jiǎn)單，離心后用傾倒法即可將上清夜與沉淀分開，并可使用容量較大的角式轉(zhuǎn)子。缺點(diǎn)是：①分離效果差，不能一次得到純顆粒；②壁效應(yīng)嚴(yán)重，特別是當(dāng)顆粒很大或濃度很高時(shí)，在離心管一側(cè)會(huì)出現(xiàn)沉淀；③顆粒被擠壓，離心力過大、離心時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)使顆粒變形、聚集而失活。

　2． 密度梯度離心法：

區(qū)帶離心法是樣品在一定惰性梯度介質(zhì)中進(jìn)行離心沉淀或沉降平衡，在一定離心力下把顆粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同區(qū)帶的分離方法。該法的優(yōu)點(diǎn)是：①分離效果好，可一次獲得較純顆粒；②適應(yīng)范圍廣，既能分離具有沉淀系數(shù)差的顆粒，又能分離有

一定浮力密度的顆粒；③顆粒不會(huì)積壓變形，能保持顆?；钚?，并防止已形成的區(qū)帶由于對(duì)流而引起混合。缺點(diǎn)：

① 離心時(shí)間較長(zhǎng)；②需要制備梯度；③操作嚴(yán)格，不宜掌握。

下列技術(shù)使用了密度梯度，即離心管中的溶液從管中的溶液從管頂?shù)焦艿酌芏戎饾u增加：

密度梯度。

（a）連續(xù)密度梯度。（b）非連續(xù)密度梯度，以遞減濃度的梯度平鋪疊加而形成。（c）單梯度密度屏障，設(shè)計(jì)用于選擇性的沉降一種類型的顆粒

3.   差速區(qū)帶離心法：

將樣品置于平緩的預(yù)先制好密度梯度介質(zhì)上，進(jìn)行離心，較大的顆粒將比較小的顆粒更快地沉降

通過梯度介質(zhì)，形成幾個(gè)明顯的區(qū)帶（條帶）。這種方法有時(shí)間限制，在任一區(qū)帶到達(dá)管底之前必須停止離心。差速區(qū)帶離心法僅用于分離有一定沉降系數(shù)差的顆粒，與密度無關(guān)。大小相同、密度不同的顆粒（如溶酶體、線粒體和過氧化物酶體）不能用本法分離。

離心時(shí)，由于離心力的作用，顆粒離開原樣品層，按不同沉降速率沿管底沉降。離心一定時(shí)間后，沉降的顆粒逐漸分開，zui后形成一系列界面清楚的不連續(xù)區(qū)帶。沉降系數(shù)越大，往下沉降的越快，所呈現(xiàn)的區(qū)帶也越低。沉降系數(shù)較小的顆粒，則在較上部分依次出現(xiàn)。從顆粒的沉降情況看來，離心必須在沉降z(mì)ui快的顆粒（大顆粒）到達(dá)管底前或剛到達(dá)管底時(shí)結(jié)束，使顆粒處于不*的沉降狀態(tài)，而出現(xiàn)在某一些特定的區(qū)帶內(nèi)。

在離心過程中，區(qū)帶的位置和形狀（或帶寬）隨時(shí)間而改變，因此，區(qū)帶的寬度不僅取決于樣品組分的數(shù)量、梯度的斜率、顆粒的擴(kuò)散作用和均一性，也與離心時(shí)間有關(guān)。時(shí)間越長(zhǎng)，區(qū)帶越寬。適當(dāng)增加離心力可縮短離心時(shí)間，并可減少擴(kuò)散導(dǎo)致的區(qū)帶加寬現(xiàn)象，增加區(qū)帶界面的穩(wěn)定性。

4. 等密度離心法：

當(dāng)不同顆粒存在浮力密度差時(shí)，在離心力場(chǎng)下，顆粒或向下沉降，或向上浮起，一直沿梯度移動(dòng)到它們密度恰好相等的位置上（即等密度點(diǎn)）形成區(qū)帶，稱為等密度離心法。等密度離心的有效分離取決于顆粒的浮力密度差，密度差越大，分離效果越好，與顆粒的大小和形狀無關(guān)。但后兩者決定著達(dá)到平衡的速率、時(shí)間和區(qū)帶的寬度。顆粒的浮力密度不是恒定不變的，還與其原來密度、水化程度及梯度溶質(zhì)的同透性或溶質(zhì)與顆粒的結(jié)合等因素有關(guān)。例如某些顆粒容易發(fā)生水化使密度降低。

這種技術(shù)根據(jù)浮力密度的不同分離物質(zhì)。其分辨率受顆粒性質(zhì)（密度、均一性、含量）、梯度性質(zhì)（形狀、粘度、斜率）轉(zhuǎn)子類型、離心速率和時(shí)間的影響。顆粒區(qū)帶寬度與梯度斜率、離心力、顆粒相對(duì)分子質(zhì)量成正比。幾種物質(zhì)可通過離心法形成密度梯度（如蔗糖、葡萄糖、菲可、尼克登）。將樣品與適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)混合后離心——各種顆粒在與其等密度的介質(zhì)帶處形成沉淀區(qū)帶。這種方法要求介質(zhì)梯度應(yīng)有一定的陡度，要有足夠的離心時(shí)間形成梯度顆粒的再分配，進(jìn)一步離心對(duì)其不會(huì)有影響。

可以使用一根細(xì)的巴氏滴管或帶有細(xì)長(zhǎng)針頭的注射器來收集某個(gè)密度梯度內(nèi)的條帶。另一種方法可將試管刺穿，將內(nèi)容物分段逐滴收集到幾個(gè)管中。

三、離心機(jī)的類型：

 四、 轉(zhuǎn)子

許多離心機(jī)可以配用不同大小的離心管，只需要改變轉(zhuǎn)子或使用一個(gè)與不同的吊桶/適配器相配的轉(zhuǎn)子。

1．水平轉(zhuǎn)子：盛樣品的離心管放在吊桶內(nèi)，以轉(zhuǎn)子的加速度運(yùn)轉(zhuǎn)。水平轉(zhuǎn)子用于低速離心機(jī)，其主要缺陷是延長(zhǎng)了沉淀的路徑。同時(shí)，減速過程中產(chǎn)生的對(duì)流會(huì)引起沉淀物的重新懸浮。

2．角式轉(zhuǎn)子：許多高速離心機(jī)及微量離心機(jī)安裝。由于沉降路徑短，沉淀顆粒時(shí)角式轉(zhuǎn)子比水平轉(zhuǎn)子的效率更高。

3．垂直管轉(zhuǎn)子：用于高速及超高速離心機(jī)進(jìn)行等密度梯度離心時(shí)。這種轉(zhuǎn)子在沉淀沒有形成之前不能用來收集懸浮液中的顆粒。

    轉(zhuǎn)子：（a）水平轉(zhuǎn)子；（b）固定轉(zhuǎn)角轉(zhuǎn)子；（c）垂直離心管轉(zhuǎn)子

五、離心管

離心管有各種大?。?/span>1.5ml到1000ml），所用材料也不一，下面是選擇離心管時(shí)應(yīng)考慮的一些性能。

1)      容量。由樣品的體積決定。注意在有些應(yīng)用中（如高速離心）離心管必須裝滿。

2)      形狀。收集沉淀時(shí)，用圓錐性管底的離心管較好，而進(jìn)行密度梯度離心時(shí)圓底試管

更有用。

3)      zui大離心力。詳細(xì)信息由廠家提供。

4)      耐腐蝕性。玻璃管是惰性物質(zhì)，聚碳酸酯管對(duì)有機(jī)溶劑（如乙醇、丙酮）敏感，而

聚丙烯具有更好的耐腐蝕性。詳細(xì)信息可參考廠家的說明書。

5)      滅菌。一次性塑料離心管出廠時(shí)通常是消過毒的。玻璃管及聚丙烯管可重復(fù)滅菌使

用。多次高壓滅菌可能會(huì)導(dǎo)致聚碳酸酯崩裂或變形。

6)      透明度。玻璃管和聚碳酸酯是透明的，而聚丙烯管為半透明。

7)      能否刺穿。若你想用刺穿管壁的方法收集樣品，纖維素乙酸管和聚丙烯管易于用注

射管針頭刺穿。

8)      管帽。大多數(shù)角式及垂直管式轉(zhuǎn)子要求離心管有管帽，用以防止使用過程中樣品漏

出并在離心過程中支撐離心管，防止其離心時(shí)變形。對(duì)于放射性樣品，即使是低速離心也一定要蓋管帽，并且要使用與所用離心管配套的管帽。

六、平衡轉(zhuǎn)子：

為確保離心機(jī)的安全運(yùn)轉(zhuǎn)，使用時(shí)必須平衡轉(zhuǎn)子，否則轉(zhuǎn)軸及轉(zhuǎn)子組件可能會(huì)損壞；嚴(yán)重時(shí)轉(zhuǎn)子可能會(huì)停轉(zhuǎn)，造成事故。記得不可以用目測(cè)來平衡離心管——而要用天平。一個(gè)35ml盛滿液體的試管在3000gRCF的加速下旋轉(zhuǎn)，其有效重量要大于一個(gè)大塊頭的成年男子。

要點(diǎn)：使用前平衡離心管至關(guān)重要，通常的原則是用托盤天平平衡所有樣品管，差值

控制在1%以內(nèi)或更少。把平衡好的試管成對(duì)放在相對(duì)的位置上。

七、安全措施：

由于離心機(jī)的高速旋轉(zhuǎn)并由此產(chǎn)生極大的力，如使用方法不正確，可能造成及其危險(xiǎn)的隱患。為了安全起見，所有離心機(jī)內(nèi)裝有一塊包圍著轉(zhuǎn)子的鋼板，以避免轉(zhuǎn)子出故障時(shí)會(huì)有碎片飛出。離心機(jī)通常有一個(gè)安全鎖，以確保機(jī)蓋蓋上時(shí)電機(jī)才轉(zhuǎn)動(dòng)，同時(shí)阻止在轉(zhuǎn)子停止運(yùn)轉(zhuǎn)之前打開機(jī)蓋。不要使用沒有安全鎖的老式離心機(jī)或鎖裝置壞了的離心機(jī)。尤其注意確保頭發(fā)及衣服遠(yuǎn)離旋轉(zhuǎn)部件。