我們這里討論瑯伯-比爾定律的限制性條件。其一：通過溶液的光必須是平行的；其二：通過溶液的光必須是單色光；其三：待測(cè)溶液必須是純凈的、均勻的且濃度不宜過高，這是瑯伯-比爾定律首要的三個(gè)前提條件。但是在實(shí)際的分光光度計(jì)的制造和使用過程中這三個(gè)條件是不可能達(dá)到的。其一：因?yàn)楣馐侵本€傳播的，在分光光度計(jì)制造過程中，燈源發(fā)出的光是發(fā)散的，經(jīng)過聚焦鏡進(jìn)行聚焦等直到經(jīng)過溶液的整體過程中，光是不可能平行的。其二：燈源發(fā)出的光是復(fù)合光，經(jīng)過狹縫，再經(jīng)過光柵分光等步驟，因?yàn)槭艿姜M縫和光柵本身的限制，光柵分光不可能達(dá)到純單色光。還有光度計(jì)的整體設(shè)計(jì)問題，光度計(jì)不可能沒有其它的雜光存在。其三：用戶的溶液也不可能是純凈的，也會(huì)含有一些雜質(zhì)，這些對(duì)光度的吸收都會(huì)存在影響。除以上三個(gè)方面的影響外，在實(shí)際的光度計(jì)應(yīng)用過程中還會(huì)存在其他因素的影響，例如：1、經(jīng)過比色皿的光是否垂直；2、比色皿寬度是否為10mm的標(biāo)準(zhǔn)值；3、測(cè)試波長(zhǎng)是否準(zhǔn)確；4、程序設(shè)計(jì)是否存在漏洞等等，都會(huì)直接影響到利用瑯伯-比爾定律計(jì)算出的結(jié)果。
所以在日常的測(cè)試過程中，得出的結(jié)果和瑯伯-比爾定律有些偏差是很正常的，只是我們關(guān)注偏差多少的問題。
二、分光光度計(jì)使用的外部環(huán)境要求
分光光度計(jì)屬于精密儀器，應(yīng)當(dāng)妥善保管和精心維護(hù)，這樣才能保證分光光度計(jì)長(zhǎng)期使用、長(zhǎng)期的穩(wěn)定可靠、測(cè)量精度高。元析公司在多年的生產(chǎn)和應(yīng)用的過程中，得到了一套在一定環(huán)境下維護(hù)分光光度計(jì)的經(jīng)驗(yàn)，具體如下：
1、環(huán)境溫度在條件容許的情況下，盡量保持在15-30攝氏度之間，這樣能保持電器件穩(wěn)定工作，不易老化，使分光光度計(jì)不易損壞，燈源的使用壽命得到延長(zhǎng)。若條件不容許，在高溫的情況下，縮短開機(jī)時(shí)間，使用分光光度計(jì)，使電器件不要長(zhǎng)期保持在高溫下。在低溫下，使預(yù)熱時(shí)間比常溫下的預(yù)熱時(shí)間要長(zhǎng)，這樣能保證在儀器穩(wěn)定的情況下進(jìn)行測(cè)試。
2、環(huán)境濕度在條件容許的情況下，盡量保持在60%以下，這樣能保證光度計(jì)內(nèi)部的光學(xué)件和電器件不易受潮、腐蝕、和上霉。若條件不容許，在高濕度和低濕度的情況盡量保持通風(fēng)。
3、環(huán)境在條件容許的情況下盡量保持潔凈，打掃環(huán)境時(shí)動(dòng)作不宜太大，不要揚(yáng)起灰塵，打掃之前用防塵罩蓋上分光光度計(jì)，不要讓灰塵進(jìn)入分光光度計(jì)內(nèi)部。
以上僅就儀器使用的外部環(huán)境作了描述，以供使用用戶參考。
三、吸光光度法及722 型分光光度計(jì)的使用
吸光光度法
基于物質(zhì)對(duì)不同波長(zhǎng)的光波具有選擇性吸收的能力而建立起來的分析方法。
（一） 光線：
光線的波長(zhǎng)： 200nm-400nm 紫外線*
400-750nm可見光*>750nm 紅外線
光具有波粒二相性，波長(zhǎng)不同，其能量不同。
（二） 物質(zhì)的吸收光譜及顏色：
1． 物質(zhì)的原子吸收光譜和原子發(fā)射光譜：原子的zui外層電子可以選擇性吸收特征波長(zhǎng)的電磁波成為
激發(fā)態(tài)而產(chǎn)生的光譜稱為原子吸收光譜。激發(fā)態(tài)原子恢復(fù)到基態(tài)，則釋放出特征波長(zhǎng)的光子，形成原子發(fā)射光譜。不同的溶液其光譜不同，即不同溶液對(duì)不同波長(zhǎng)的光其吸收能力不同，對(duì)某一特定波長(zhǎng)的光存在吸收峰。
2． 可見光由赤橙黃綠青蘭紫等能量不同的光線組成，當(dāng)可見光穿過某一溶液時(shí)，由于特定波長(zhǎng)的
光被吸收而使溶液呈現(xiàn)相應(yīng)的顏色。（如CuSO4由于吸收了可見光中的黃光（600nm）而成藍(lán)色）不同顏色的溶液對(duì)不同波長(zhǎng)的光其吸收能力不同。
（三） 光吸收的基本定律（Lambert-Beer 定律）：
一束平行單色光（Io）通過有色的透明溶液時(shí)，一部分的光可以透過溶液（It），另一部分被溶液吸收（Ia）,還有一部分被器皿表面反射（Ir）,則：
Io=It+Ia+Ir 。那么，該溶液透光率為: T = It / Io 。
1． Lambert 定律：設(shè)有一束平行單色光,通過液層厚度為b 的均勻透明溶液,則溶液對(duì)光的吸收能力:
A=Ig（Io/It）=Ig（1/T）=k2b
k2 為吸光系數(shù)，為常數(shù)。與入射光波長(zhǎng)、溶液性質(zhì)、濃度和溫度有關(guān)；A 為吸光度（又稱光密度
O.D 或消光度E），當(dāng)入射光波長(zhǎng)、吸光溶液的濃度和溫度一定時(shí)，A 與b 成正比。
2． Beer 定律：設(shè)有一束平行單色光,通過濃度為c 的均勻透明溶液,則溶液對(duì)光的吸收能力:
A=Ig（Io/It）=Ig（1/T）=k4c
k2 為常數(shù)。由Beer 定律可知：當(dāng)入射光波長(zhǎng)、吸光溶液的厚度和溫度一定時(shí)，A 與c 成正比。
3． Lambert-Beer 定律：綜合1.2.得： A=Kbc ,
即：當(dāng)入射光波長(zhǎng)、吸光溶液的性質(zhì)和溫度一定時(shí)，A 與b、c 成正比。
（四） 吸光光度法的基本原理：
1、 不同物質(zhì)，由于其分子結(jié)構(gòu)和原子組成不同，故對(duì)光的吸收光譜不同（如：CuSO4），在測(cè)定不同顏
色的物質(zhì)濃度時(shí)要用zui大吸收的波長(zhǎng)的入射光，這樣測(cè)量的靈敏度zui高。
2、 同一種物質(zhì)，若濃度不同，則對(duì)同一波長(zhǎng)的入射光的吸收能力（吸光度）也不同，且成正比關(guān)系。
3、
應(yīng)此，利用特定波長(zhǎng)的單色光（通常用zui大吸收波長(zhǎng)的入射光）照射不同濃度的某一溶液時(shí)，所得的吸光度大小應(yīng)與溶液濃度呈線性關(guān)系，故可利用該線性關(guān)系通過計(jì)算或查標(biāo)準(zhǔn)曲線來求得未知溶液的濃度。
（五） 吸光光度法特點(diǎn)：
1． 靈敏度高：mg%級(jí)、甚至ug%級(jí)。
2． 準(zhǔn)確度高：誤差2-5%
3． 操作簡(jiǎn)便、快速，儀器設(shè)備不復(fù)雜，價(jià)格低廉，故應(yīng)用廣泛。
分光光度計(jì)的使用：
（一） 分光光度計(jì)的基本原理：利用吸光光度法的原理，采用棱鏡或光柵等分光器獲得純度較高的單色光
來測(cè)量未知溶液的濃度的方法。
（二） 常用分光光度計(jì)：可見光、紫外、紅外分光光度計(jì)，
熒光分光光度計(jì)，火焰分光光度計(jì)等。
（三） 722 型分光光度計(jì)的結(jié)構(gòu)（略）
（四） 分光光度計(jì)的操作步驟
1）預(yù)熱儀器。為使測(cè)定穩(wěn)定，將電源開關(guān)打開，使儀器預(yù)熱20min，為了防止光電管疲勞，不要連續(xù)光照。預(yù)熱儀器時(shí)和在不測(cè)定時(shí)應(yīng)將比色皿暗箱蓋打開，使光路切斷。
2）選定波長(zhǎng)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，轉(zhuǎn)動(dòng)波長(zhǎng)調(diào)節(jié)器，使指針指示所需要的單色光波長(zhǎng)。
3）固定靈敏度檔。根據(jù)有色溶液對(duì)光的吸收情況，為使吸光度讀數(shù)為0.2-0.7，選擇合適的靈敏度。為此，旋動(dòng)靈敏度檔，使其固定于某一檔，在實(shí)驗(yàn)過程中不再變動(dòng)。一般測(cè)量固定在“1”檔。
4）調(diào)節(jié)“0”點(diǎn)。輕輕旋動(dòng)調(diào)“0”電位器，使讀數(shù)表頭指針恰好位于透光度為“0”處（此時(shí)，比色皿暗箱蓋是打開的，光路被切斷，光電管不受光照）。
5）調(diào)節(jié)T=100％。將盛蒸餾水（或空白溶液或純?nèi)軇┑谋壬蠓湃氡壬笞苤械?格內(nèi)，有色溶液放在其它格內(nèi)，把比色皿暗箱蓋子輕輕蓋上，轉(zhuǎn)動(dòng)光量調(diào)節(jié)器，使透光度T=100％，即表頭指針恰好指在T=100％處。
6）測(cè)定。輕輕拉動(dòng)比色皿座架拉桿，使有色溶液進(jìn)入光路，此時(shí)表頭指針?biāo)緸樵撚猩芤旱奈舛華。讀數(shù)后，打開比色皿暗箱蓋。
7）關(guān)機(jī)。實(shí)驗(yàn)完畢，切斷電源，將比色皿取出洗凈，并將比色皿座架及暗箱用軟紙擦凈。
注意事項(xiàng)：
1）為了防止光電管疲勞。不測(cè)定時(shí)必須將比色皿暗箱蓋打開，使光路切斷，以延長(zhǎng)光電管使用壽命。
2）比色皿的使用方法：
①拿比色皿時(shí)，手指只能捏住比色皿的毛玻璃面，不要碰比色皿的透光面，以免沾污。
②清洗比色皿時(shí)，一般先用水沖洗，再用蒸餾水洗凈。如比色皿被有機(jī)物沾污，可用鹽酸-乙醇混合洗滌液（1∶2）浸泡片刻，再用水沖洗。不能用堿溶液或氧化性強(qiáng)的洗滌液洗比色皿，以免損壞。也不能用毛刷清洗比色皿，以免損傷它的透光面。
每次做完實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)立即洗凈比色皿。
③比色皿外壁的水用擦鏡紙或細(xì)軟的吸水紙吸干，以保護(hù)透光面。
④測(cè)定有色溶液吸光度時(shí)，一定要用有色溶液洗比色皿內(nèi)壁幾次，以免改變有色溶液的濃度。另外，在測(cè)定一系列溶液的吸光度時(shí)，通常都按由稀到濃的順序測(cè)定，以減小測(cè)量誤差。
⑤在實(shí)際分析工作中，通常根據(jù)溶液濃度的不同，選用液槽厚度不同的比色皿，使溶液的吸光度控制在0.2～0.7。
四、分光光度計(jì)的性能檢查
（1）波長(zhǎng)校正：使用光電比色計(jì)或分光光度計(jì)，在更換光源燈、重新安裝、搬運(yùn)或檢修后，以及儀器工作不正常時(shí)，都要進(jìn)行波長(zhǎng)校正。就是正常工作的儀器，每隔一個(gè)月也要檢查一次波長(zhǎng)，必要時(shí)進(jìn)行校正，這樣才能保證波長(zhǎng)讀數(shù)與通過樣品的波長(zhǎng)符合，保證儀器的zui大靈敏度。方法常用譜釹濾光片校正法，適用于721型儀可見光區(qū)的波長(zhǎng)校正，常以585nm或529nm處的吸收峰或T%為標(biāo)準(zhǔn)。鑒于721型儀器的出射光波長(zhǎng)較寬，不易將573nm和585nm的兩峰或兩谷分開，校正時(shí)易產(chǎn)生誤差，故推薦用529nm處的峰或谷為標(biāo)準(zhǔn)來進(jìn)行波長(zhǎng)校正。校正時(shí)，將儀器按要求預(yù)熱。要求電源電壓穩(wěn)定。波長(zhǎng)度盤置580nm處，T%調(diào)至zui大，在比色杯處放一白紙條，觀察是否有光強(qiáng)均勻、邊緣無光暈或雜光的光斑，如不符合要求，可調(diào)節(jié)燈泡位置使其符合要求，是為波長(zhǎng)校正的粗調(diào)。再把靈敏度扭置于“1”（zui低檔），波長(zhǎng)度盤對(duì)準(zhǔn)529nm，電表機(jī)械零點(diǎn)為零，在光路空白時(shí)調(diào)T%為100%T，并反復(fù)查零點(diǎn)和100%T穩(wěn)定情況。將譜釹濾光片插入光路，慢慢旋轉(zhuǎn)波長(zhǎng)度盤，找到透光率zui低的一點(diǎn)（向左右微旋波長(zhǎng)度盤時(shí)，該點(diǎn)透光率值均增加），這一點(diǎn)即為波長(zhǎng)529nm。檢查波長(zhǎng)度盤的指示值是不是529nm，如指示值為534nm，此時(shí)波長(zhǎng)工誤差為5nm，超出規(guī)定（±1nm）必須進(jìn)行調(diào)整。
